表位作圖技術(shù)

氫氘交換 (HDX-MS)

HDX-MS測(cè)量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)骨架中氫分子的可及性。在分析過程中，未結(jié)合的抗原和結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物都在氘 (D₂O) 水中孵育，以便將任何酰胺氫與來(lái)自蛋白質(zhì)骨架暴露氨基酸的氘交換。然后可以使用高分辨率質(zhì)譜法仔細(xì)確定這些氘分子在蛋白質(zhì)序列上的位置。通過比較未結(jié)合的抗原與結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物，可以確定表位的殘基。該技術(shù)需要仔細(xì)控制反應(yīng)的溫度、pH 值和時(shí)間。

HDX-MS 的其他應(yīng)用通過 CovalX 的 HDX 分析利用高分辨率分子結(jié)構(gòu)視圖用于以下項(xiàng)目：

?  生物仿制藥表征

?  高階結(jié)構(gòu)

?  構(gòu)象/蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)

? 小分子相互作用

? 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

? 蛋白質(zhì)折疊表征

交聯(lián)耦合質(zhì)譜 (XL-MS)

超大質(zhì)譜儀首先用質(zhì)量標(biāo)記的化學(xué)交聯(lián)劑結(jié)合抗體和抗原。接下來(lái)，使用高質(zhì)量 MALDI 檢測(cè)確認(rèn)復(fù)合物的存在。由于在應(yīng)用交聯(lián)化學(xué)后，Ab/Ag 復(fù)合物非常穩(wěn)定，因此可以將多種酶（五種并行使用）和消化條件應(yīng)用于復(fù)合物以提供許多不同的重疊肽。這些肽的鑒定使用高分辨率 Orbitrap? 質(zhì)譜和 MS/MS 技術(shù)進(jìn)行。使用連接到交聯(lián)試劑的質(zhì)量標(biāo)簽來(lái)確定交聯(lián)肽的識(shí)別。使用特定相互作用軟件進(jìn)行 MS/MS 碎裂和數(shù)據(jù)分析后，在同一實(shí)驗(yàn)中確定表位和互補(bǔ)位。由于質(zhì)譜檢測(cè)的高靈敏度和準(zhǔn)確度，需要的材料量非常少。

XL-MS 的其他應(yīng)用：

?  蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

? 映射聚合

? 平行互補(bǔ)位映射分析

█ 其他技術(shù)

X射線共晶

X 射線共晶體學(xué)通常被認(rèn)為是表位作圖的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。如果成功，該技術(shù)可以提供高度可信的單一氨基酸分辨率，盡管可能會(huì)遺漏靈活的區(qū)域。然而，這種技術(shù)并不總是可行的，因?yàn)閺牡鞍踪|(zhì)復(fù)合物中生成晶體往往很困難，而且在許多情況下是不可能的。這種不確定性通常會(huì)導(dǎo)致項(xiàng)目完成的時(shí)間表很長(zhǎng)或不確定。在晶體形成復(fù)雜的情況下，可以繪制較小的蛋白質(zhì)片段或修飾的蛋白質(zhì)，這可能會(huì)引起修飾蛋白質(zhì)時(shí)的關(guān)注。此外，X 射線分析需要大量蛋白質(zhì)樣品，而且完成一個(gè)項(xiàng)目通常需要大量成本。

肽掃描

在這種技術(shù)中，從抗原中產(chǎn)生了一系列重疊的肽。然后分析這些肽以查看它們是否會(huì)破壞抗體和抗原之間復(fù)合物的形成。這是最常見的技術(shù)之一，因?yàn)樗某杀鞠鄬?duì)較低，并且能夠快速分析大量抗體。該技術(shù)主要用于線性表位的分析。

誘變

使用這種技術(shù)，抗原的特定氨基酸殘基發(fā)生突變或改變（通常為丙氨酸），并檢測(cè)復(fù)合物的存在（通常使用熒光）。該技術(shù)提供了表位的高氨基酸分辨率；然而，產(chǎn)生突變可能是勞動(dòng)密集型且緩慢的。為了優(yōu)化該過程，可以使用計(jì)算機(jī)以庫(kù)格式創(chuàng)建許多質(zhì)?？寺?，以執(zhí)行數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

表位可以通過兩個(gè)一般類別來(lái)定義，線性或構(gòu)象。線性（或連續(xù)）表位由序列中的一段線性氨基酸組成，沒有三維結(jié)構(gòu)。構(gòu)象表位是一種需要三級(jí)折疊才能產(chǎn)生適當(dāng)結(jié)合區(qū)域的表位。

構(gòu)象表位最常出現(xiàn)在氨基酸結(jié)合序列中具有斷裂（不連續(xù)）的區(qū)域，需要折疊結(jié)構(gòu)以使這些區(qū)域靠近。構(gòu)象作圖技術(shù)可用于鑒定線性或構(gòu)象表位。然而，線性技術(shù)不能繪制構(gòu)象表位。

根據(jù)所用技術(shù)的“分辨率”，識(shí)別的區(qū)域可以是單個(gè)氨基酸、氨基酸的小組或蛋白質(zhì)的肽段。一般來(lái)說(shuō)，更高分辨率的技術(shù)更復(fù)雜、更耗時(shí)，并且需要更多的材料/時(shí)間。

█ 服務(wù)優(yōu)勢(shì)

?  是通過 MALDI 質(zhì)譜儀快速而穩(wěn)定地檢測(cè)大分子和完整蛋白質(zhì)復(fù)合物的能力。

?  對(duì)于所有表位作圖項(xiàng)目，首先篩選單個(gè)蛋白質(zhì)以確認(rèn)質(zhì)量并檢測(cè)顯著的多聚化。然后檢測(cè)完整的復(fù)合物，并在進(jìn)行表位作圖之前確定化學(xué)計(jì)量。

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