DNA測(cè)序技術(shù),即測(cè)定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學(xué)研究中,DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。早在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(Watson and Crick,1953)被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報(bào)道過(guò)DNA測(cè)序技術(shù),但是當(dāng)時(shí)的操作流程復(fù)雜,沒(méi)能形成規(guī)模。隨后在1977年Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測(cè)序法,同年A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法。Sanger法因?yàn)榧群?jiǎn)便又快速,并經(jīng)過(guò)后續(xù)的不斷改良,成為了迄今為止DNA測(cè)序的主流;按照時(shí)間的關(guān)系,采用這兩種原理的手動(dòng)測(cè)序方法被稱(chēng)為第一代基因測(cè)序技術(shù)。
然而隨著科學(xué)的發(fā)展,傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要,對(duì)模式生物進(jìn)行基因組重測(cè)序以及對(duì)一些非模式生物的基因組測(cè)序,都需要費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù),因此第二代或者下一代自動(dòng)測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing)應(yīng)運(yùn)而生。第二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis),即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列,現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche公司的454 FLX測(cè)序儀、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序儀和Applied Biosystems Life Technology(ABI)公司的 SOLID system測(cè)序儀。這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn),454 FLX的測(cè)序片段比較長(zhǎng),高質(zhì)量的讀長(zhǎng)(read)能達(dá)到400bp;Solexa測(cè)序性價(jià)比最高,不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低,而且運(yùn)行成本也低,在數(shù)據(jù)量相同的情況下,成本只有454測(cè)序的1/10;SOLID測(cè)序的準(zhǔn)確度高,原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。
所有的下一代基因測(cè)序平臺(tái)都遵循了類(lèi)似的工作流程,如下圖所示,都要經(jīng)過(guò)克隆擴(kuò)增以加強(qiáng)測(cè)序過(guò)程中的光學(xué)靈敏度。首先,構(gòu)建DNA模板文庫(kù),通過(guò)隨機(jī)打斷基因組DNA獲得DNA文庫(kù)片段(長(zhǎng)度為數(shù)十到數(shù)百堿基),或者構(gòu)建控制距離分布的配對(duì)末端片段;在雙鏈片段的兩端連上接頭序列,然后變性得到單鏈模板文庫(kù),并固定在固體表面上,固體表面可以是平面或者微球的表面;在芯片上形成DNA簇陣列的DNA簇或者擴(kuò)增微球,利用聚合酶或者連接酶進(jìn)行一系列循環(huán)的反應(yīng)操作,通過(guò)顯微檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)控每個(gè)生化循環(huán)反應(yīng)中的產(chǎn)生的光學(xué)事件,并且用CCD相機(jī)將圖像采集并記錄下來(lái),由于數(shù)據(jù)量比較大且光信號(hào)比較弱,因此要求CCD具有很好的靈敏度且很快的讀出速度;然后對(duì)產(chǎn)生的陣列圖像進(jìn)行時(shí)序分析,獲得DNA片段的序列,然后按照一定的計(jì)算機(jī)算法將這些片段組裝成更長(zhǎng)的重疊群。
目前第二代基因測(cè)序技術(shù)是世界上主流的基因測(cè)序技術(shù),也是最為成熟的基因測(cè)序技術(shù)。
先鋒科技股份有限公司代理的CCD Camera可以用于用于基因測(cè)序中微弱熒光的探測(cè):
INFINITY 4-11M
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Luca-R
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DU897
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SCMOS
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生產(chǎn)廠家:Lumenera
產(chǎn)地:加拿大
特點(diǎn):
l 價(jià)格低廉
l 1100萬(wàn)像素,35mm大芯片設(shè)計(jì),專(zhuān)門(mén)用于配合顯微鏡
l 4008*2672,9微米像素
l 3.5f/s全分辨讀出,通過(guò)ROI和Binning可以提高到60f/s
l 8和12bit雙AD轉(zhuǎn)換
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生產(chǎn)廠家:Andor
產(chǎn)地:英國(guó)
特點(diǎn):
l 每個(gè)人都買(mǎi)得起的EMCCD
l 最大增益可以達(dá)到1000倍
l 1004×1002,8微米像素
l USB2.0計(jì)算機(jī)接口,即插即用
l 12.4f/s的讀出速度,可以通過(guò)Binning和ROI進(jìn)一步提高到235f/s
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生產(chǎn)廠家:Andor
產(chǎn)地:英國(guó)
特點(diǎn):
l 市場(chǎng)上第一臺(tái)首次整合了背感光與電子倍增技術(shù)的EMCCD,可達(dá)單光子探測(cè)靈敏度
l 512×512,16um像素
l 35f/s的全幅讀出速度,可以通過(guò)Binning和ROI進(jìn)一步提高到549f/s
l 具備增益老化校準(zhǔn)功能,永遠(yuǎn)的定量測(cè)試
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生產(chǎn)廠家:Andor
產(chǎn)地:英國(guó)
特點(diǎn):
l 世界上第一臺(tái)能同時(shí)擁有CMOS相機(jī)讀出速度與CCD靈敏度的科研級(jí)CMOS相機(jī)
l 一英寸芯片尺寸,2560*2160,可達(dá)550萬(wàn)像素
l 動(dòng)態(tài)范圍:30000:1
l TE制冷:-40度
l >100f/s全幅讀出
l 最大QE>57%
l 讀出噪聲:1.4e@560MHz
l 已經(jīng)在DNA測(cè)序領(lǐng)域得到極為成功的應(yīng)用
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