棕色脂肪（BAT）是通過UCP1依賴性呼吸介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物非顫抖產(chǎn)熱的主要部位，低溫觸發(fā)線粒體氧化磷酸化和UCP1介導(dǎo)的解偶聯(lián)作用，從而在BAT中快速產(chǎn)生熱量。在生物體內(nèi)，棕色脂肪燃燒糖和脂肪產(chǎn)生熱量，其中UCP1的產(chǎn)熱作用可以預(yù)防環(huán)境溫度快速降低時(shí)產(chǎn)生的致命低溫，該理論已受到廣泛的關(guān)注，但其快速產(chǎn)熱的轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚不明確。
在一項(xiàng)新的研究中，來自美國賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員詳細(xì)地描繪了讓這些棕色脂肪細(xì)胞釋放熱量所必需的一種分子，即組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）。相關(guān)研究結(jié)果于2017年6月14日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge”。論文通訊作者、賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院糖尿病、肥胖與代謝研究所主任Mitchell Lazar博士、他的實(shí)驗(yàn)室的博士生Matthew Emmett（也是論文共同第一作者）和他們的同事們發(fā)現(xiàn)棕色脂肪細(xì)胞缺乏HDAC3的小鼠不能夠啟動(dòng)UCP1基因，因而就與缺乏UCP1基因的小鼠那樣對(duì)寒冷的有害影響同樣地敏感。這項(xiàng)研究證實(shí)HDAC3是啟動(dòng)這種棕色脂肪細(xì)胞釋放熱量所必需的，即便當(dāng)UCP1基因保持完整時(shí)也是如此。
a)解剖小鼠，取部分棕色脂肪組織
b)低溫（冰上）將BAT剪碎至糊狀，準(zhǔn)備勻漿
c)在4℃或冰上進(jìn)行勻漿，手動(dòng)/自動(dòng)（150rpm X 8次）
d)用4℃分離緩沖液（MIB，配方見文末）進(jìn)行重懸，約15ml
e)將重懸液進(jìn)行離心，4℃、8500g、10min
f)棄掉脂質(zhì)和上清
g)將沉淀再次重懸于1ml的4℃MIB中
h)過濾（100μm），自然下落，請(qǐng)勿使用外力
i)用BCA進(jìn)行線粒體定量，約0.25mg用于O2k進(jìn)行線粒體呼吸檢測
1)底物滴定Baseline respiration (palmatoylcarnitine (4 mM), pyruvate (10 mM) and malate (5 mM))
2)UCP1蛋白阻斷劑2 mM GDP
3)滴加ADP (1 mM)開啟磷酸化過程
4)rotenone (0.5 μM)關(guān)閉線粒體復(fù)合物I
5)succinate (10 mM)開啟線粒體復(fù)合物II
6)TMPD (0.5 mM) and ascorbate (2 mM)開啟復(fù)合物IV
7)Sodium Azide (2.5 mM)關(guān)閉復(fù)合物IV
附：分離緩沖液MIB：mannitol 210 mM, sucrose 70 mM, Hepes 10 mM, EGTA 1 mM, adjusted to pH 7.2 with KOH
參考文獻(xiàn)：Emmett, Matthew, J. , Hee-Woong, Jager, Jennifer, & Richter, et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge.
1、獨(dú)有的光電聯(lián)合多參數(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測技術(shù)：
電化學(xué)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測模塊：pO2（高分辨率極譜氧電極傳感器，耗氧率檢測分辨率為±1 pmol O??s-1?mL-1）、pH、H2O2、TPP+（測量線粒體膜電位）、H2S、NO、質(zhì)體醌；
熒光實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測模塊：MMP（測量線粒體膜電位）、ATP、Ca2+、ROS、NADH；
2、獨(dú)有的原代細(xì)胞、原代組織能量代謝快速檢測技術(shù)：
無需過夜培養(yǎng)、樣品快速檢測，更加客觀反映樣品更接近體內(nèi)的能量代謝水平；
3、獨(dú)有的多維度能量代謝分析平臺(tái)：
適應(yīng)線粒體、細(xì)胞、組織塊、活檢樣品等不同層次不同水平的樣本檢測。
24孔板每孔單獨(dú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獨(dú)立切向流換液、加藥系統(tǒng)；
6個(gè)試劑池，可實(shí)現(xiàn)4-5種藥物重復(fù)、多次準(zhǔn)確加入及更換；
同時(shí)檢測產(chǎn)酸率、耗氧率、細(xì)胞膜電阻抗；
實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)影像跟監(jiān)測相結(jié)合的儀器；
全自動(dòng)移液站，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測幾小時(shí)、幾天、幾周至數(shù)月的長期實(shí)驗(yàn)。