血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) 是一種已知參與許多生理和病理事件的自身糖蛋白。該分子是用于癌癥治療的抗血管生成的主要靶標(biāo)。第一個(gè)針對(duì)促血管生成因子的治療產(chǎn)品是一種人源化的抗VEGF mAb，稱為貝伐珠單抗。
1.概述
研究歷史記錄抗貝伐珠單抗的獨(dú)特型mAb，10.D7，它能促使血管內(nèi)皮生長因子和抗體結(jié)合，并在腫瘤小鼠模型中顯示出相當(dāng)?shù)闹委煗摿Α?022年12月8日，圣保羅聯(lián)邦大學(xué)的Tábata Almeida Silva團(tuán)隊(duì)在Nature上發(fā)表一篇名為《Potential of an anti-bevacizumab idiotype scFv DNA-based immunization to elicit VEGF-binding antibody response》的文章，旨在評(píng)估10.D7 mAb的scFv在用作免疫原時(shí)是否能保持相應(yīng)全長mAb的抗獨(dú)特型特性并激活VEGF結(jié)合的抗體反應(yīng)。
2.2.材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)
HEK 293 T細(xì)胞（ATCC，Manassas，VA，USA）在DMEM（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培養(yǎng)，而B16-F10細(xì)胞（ATCC）在RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific）中培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)基都補(bǔ)充了10%的胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific）。
10.D7雜交瘤細(xì)胞維持在含有10% FBS和50μM 2-巰基乙醇的RPMI-1640中。
所有細(xì)胞在37°C和5%二氧化碳的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，并定期檢查支原體污染。

10.D7 scFv基因的構(gòu)建
用TRIzol (Thermo Fisher Scientific)從106個(gè)10.D7 雜交瘤細(xì)胞中分離總 RNA。如前所述，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）（表 1）分別用寡核苷酸A和C合成VH 和 VL 的 cDNA。

然后分別使用 A + B 和 C + D 寡核苷酸對(duì)（每個(gè) 1 μM）通過 PCR 擴(kuò)增編碼 10.D7 mAb 的 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域的 DNA 片段（表1).

表 1 用于從 10.D7 mAb 分離 VH 和 VL 的引物序列
抗體重鏈擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min；40個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，62℃30秒，72℃1分鐘；最后在 72 °C 下孵育 5 分鐘。輕鏈擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min；40個(gè)循環(huán)，94°C 1分鐘，60°C 30秒，72°C 1分鐘；在 72 °C 下保持 5 分鐘。

動(dòng)物
6-8 周大的雄性 C57Bl/6 小鼠來自于“Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia”（CEDEME/UNIFESP，巴西），并保持光暗12:12小時(shí)進(jìn)行循環(huán)和水自由采食。在用氯胺酮 (100 mg/kg; Syntec, Brazil) 和甲苯噻嗪 (10 mg/kg; Syntec) 進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠因麻醉劑過量而被安樂死。所有程序均符合美國國家研究委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用的指南。

酶免疫測定 (ELISA) 研究
分別進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合ELISA測定以評(píng)估 10.D7 scFv 基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是否被貝伐珠單抗識(shí)別，間接 ELISA 以檢測血清樣品中的 VEGF 結(jié)合抗體。
在這兩種測定中，在室溫下與過氧化物酶-鏈霉親和素 (Sigma) 孵育 30 分鐘后，用鄰苯二胺底物 (Sigma)顯色孔。用 4 NH 2 SO 4 (Merck, Germany)終止反應(yīng)，并在 490 nm 處讀取吸光度值。

3.結(jié)果與討論
輕鏈 (L) 和重鏈 (H) 的可變區(qū) (Fv) 的基因從 10.D7 雜交瘤細(xì)胞中分離，測序，并用于構(gòu)建 VH-VL 方向的常規(guī) scFv。

圖a：顯示 340-bp 和 324-bp 條帶，分別指純化的 FvH 和 FvL 產(chǎn)品，這些序列的 BLAST 分析顯示分別與其他 FvH 和 FvL 小鼠免疫球蛋白鏈具有 ~94% 和 ~97% 的同源性。

圖b：用EcoRI/HindIII消化構(gòu)建的質(zhì)粒DNA釋放出約830-bp的插入片段，其可能對(duì)應(yīng)于scFv基因。

設(shè)計(jì)的 scFv 可以保留親本全長 mAb 的貝伐珠單抗結(jié)合能力，表達(dá)的 10.D7 scFv 可能模擬 VEGF 并誘導(dǎo)包含對(duì) VEGF 反應(yīng)的抗體的免疫反應(yīng)，并且有明顯的抗腫瘤活性。

4.結(jié)論
綜上，我們的結(jié)果揭示了一種有前景的 scFv，它可以保留先前描述的親本 mAb 的抗貝伐珠單抗 Id 特征?；讵?dú)特型網(wǎng)絡(luò)，設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)有可能在 DNA（甚至 mRNA）疫苗中探索以激活 VEGF 結(jié)合反應(yīng)

01相關(guān)服務(wù)展示

本文相關(guān)重點(diǎn)服務(wù)推薦

1

人源scFV抗體庫構(gòu)建服務(wù)

Single-chain Fv（scFv）抗體文庫是指將抗體的可變區(qū)（VH和VL）基因，尤其是CDR區(qū)域（互補(bǔ)決定區(qū)）采用不同的策略和方式，如氨基酸突變，移碼讀框等形成數(shù)目龐大的不同克隆，并從這些克隆中篩選出針對(duì)目的抗原的高親和力單鏈Fv抗體。

2

抗獨(dú)特型抗體開發(fā)服務(wù)

治療性抗體藥物（ADC藥物）一般利用分離自抗體可變區(qū)的CDR1或者CDR3結(jié)構(gòu)域與藥物分子進(jìn)行偶聯(lián)，以達(dá)到在體內(nèi)特異性靶向治療目的，如特異性的識(shí)別癌癥細(xì)胞等。抗獨(dú)特型（Anti-idiotype）抗體，是一種能夠直接識(shí)別、結(jié)合另一抗體可變區(qū)，即上述CDR區(qū)域的抗體。

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酶免疫測定 (ELISA)

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)分析，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的方法。其是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體上，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，可對(duì)抗原或者抗體進(jìn)行定性或者定量測定。