雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù) 
 
雙熒光素酶報告基因法（luciferase Assay）檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用
 
轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╨uciferase Assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，其原理簡述如下：
（1）       構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。
（2）       將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
（3）       加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

 
實(shí)驗步驟：
（1）       用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2）       設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。
（3）       篩選陽性克隆，測序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4）       擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。
（5）       培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。
（6）       將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
（7）       提取蛋白并用于熒光素酶檢測。
（8）       加入底物，測定熒光素酶的活性。
（9）       計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較。
 
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