上海卓康以質(zhì)量為本，樹立“卓康質(zhì)量”是公司的發(fā)展目標(biāo)。我們一直加倍努力，竭盡全力做到不辜負(fù)您的支持與信賴。同時(shí)公司也離不開廣大客戶的幫助支持，真誠(chéng)邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)外有實(shí)力的實(shí)驗(yàn)室、生物技術(shù)公司合作，共同發(fā)展。 目前卓康提供的服務(wù)范圍包括：生物合成siRNA、shRNA的制備；轉(zhuǎn)錄編碼shRNA的DNAs、轉(zhuǎn)錄編碼shRNA的質(zhì)粒載體訂購(gòu)；siRNA靶位的設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)選擇分析；siRNA相關(guān)試劑和RNA技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品的代理銷售；重組病毒構(gòu)建包裝；基因蛋白表達(dá)、載體構(gòu)建、多克隆抗體和單克隆抗體制備；多種細(xì)胞學(xué)服務(wù)；常用的分子生物學(xué)試劑、實(shí)驗(yàn)儀器、實(shí)驗(yàn)耗材銷售等。 卓康在分子生物學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，特別抗體制備技術(shù)方面同樣具有豐富經(jīng)驗(yàn)，提供快速、優(yōu)質(zhì)、性價(jià)比高的實(shí)驗(yàn)服務(wù)。 十、代做實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealTime PCR)技術(shù)服務(wù)（代做RT-PCR實(shí)驗(yàn)） ●熒光定量PCR概述 　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測(cè)核酸分子的定性方法，而且也是一個(gè)能對(duì)核酸分子進(jìn)行精確定量的有力工具。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種具有革命性意義的定量PCR技術(shù)。所謂實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。 　　目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關(guān)鍵詞的文章就達(dá)1000多篇。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)較之以前的以終點(diǎn)法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。首先，它不僅操作簡(jiǎn)便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，大大降低了污染的可能性并且無(wú)須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作。 　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測(cè)定量產(chǎn)生的偏差，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 Sunbio為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，定量PCR儀器為Corbett Research 公司生產(chǎn)的離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀Rotor-Gene 3000。 ●熒光定量化學(xué)原理介紹 ☆TaqMan熒光探針 PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如圖所示。 ☆SYBR Green熒光染料 SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點(diǎn)就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，它也比其它的探針的價(jià)格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，那它就會(huì)影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過(guò)選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。 ●熒光定量PCR中的一些術(shù)語(yǔ) 1. CT值：熒光信號(hào)有統(tǒng)計(jì)意義顯著增長(zhǎng)(即穿過(guò)閾值線)時(shí)的循環(huán)次數(shù)，或者說(shuō)是從基線到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 2. 閾值：閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。 3.CT值與起始模板的量成線性關(guān)系，數(shù)學(xué)原理如圖所示： ●主要實(shí)驗(yàn)步驟如下： 1. 設(shè)計(jì)并合成Realtime PCR引物。 2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。 3. 客戶樣品RNA抽提 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 4. RNA質(zhì)量檢測(cè) a. 紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA純度 b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。 5. 使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品： 進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 7. 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測(cè)樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBeadTM熱啟動(dòng)聚合酶來(lái)自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。 8. 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對(duì)含量。 9. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表 ●實(shí)時(shí)定量PCR全套技術(shù)服務(wù)收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn) ☆實(shí)驗(yàn)步驟 1至9個(gè)標(biāo)本10個(gè)標(biāo)本以上 組織或細(xì)胞RNA抽提 RNA質(zhì)量檢測(cè) cDNA制備 300元(一個(gè)組織或細(xì)胞標(biāo)本) 270元(一個(gè)組織或細(xì)胞標(biāo)本) 目的基因?qū)崟r(shí)定量PCR 看家基因?qū)崟r(shí)定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 數(shù)據(jù)分析 200元(一個(gè)標(biāo)本一個(gè)指標(biāo)) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及看家基因內(nèi)參免費(fèi) 180元(一個(gè)標(biāo)本一個(gè)指標(biāo)) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及看家基因內(nèi)參免費(fèi) ☆全套技術(shù)服務(wù) 您只需提供組織或細(xì)胞標(biāo)本，我們?yōu)槟瓿蒖NA抽提，cDNA制備，實(shí)時(shí)定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及數(shù)據(jù)分析的所有步驟。 標(biāo)本的運(yùn)輸費(fèi)用及引物合成費(fèi)用客戶自理 如需制作PCR電泳效果圖，每張(1至9個(gè)標(biāo)本一張)收取100元 上海卓康生物科技有限公司 聯(lián)系電話：021－55660344，021－55063976 傳真：021－55660344 網(wǎng)址：www.elisabio.com 網(wǎng)址：www.antibodybio.com 聯(lián)系人：黃力，業(yè)務(wù)qq: 909447355 公司對(duì)外郵箱：sales@elisabio.com，hyperheal@gmail.com